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海藻糖在凍干保護中的應用分享

更新時間:2024-01-10   點擊次數(shù):909次

1.    引言

慢病毒載體(Lentiviral Vector,LV),基于人類免疫缺陷型病毒(HIV)發(fā)展,不僅對分裂細胞,而且對非分裂細胞都具有侵染能力。它能在體內(nèi)長期穩(wěn)定地表達基因,因此在腫瘤免疫的過繼性細胞療法中,特別是TCR-T和CAR-T細胞療法中得到了大面積應用。其中,慢病毒載體在CAR-T細胞的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中起到關(guān)鍵作用,通過攜帶目的基因的慢病毒載體侵染T細胞。而慢病毒的滴度,直接關(guān)系到侵染是否成功,是這一過程中的關(guān)鍵因素。

然而,慢病毒載體由蛋白質(zhì)和核酸組成,這使得其儲存條件面臨與其他生物制品類似的挑戰(zhàn)。例如,它通常無法在常溫或4℃冷藏條件下長時間保存,熱穩(wěn)定性差,且反復凍融會降低其滴度。目前,尚無理想的慢病毒載體凍存保護液,即使采用-80℃冷凍保存或加入甘油保護劑,也無法有效防止慢病毒載體在儲存過程中滴度降低。此外,慢病毒載體的運輸需要低溫冷鏈,這無疑增加了運輸成本,且無法百分之一百避免運輸帶來的風險。

因此,尋找一種有效的保護劑和儲存方法,以穩(wěn)定慢病毒載體的滴度并簡化其運輸過程,成為了亟待解決的問題。這其中,海藻糖作為良好的凍干保護劑,憑借其特別的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì),展現(xiàn)出巨大的應用潛力。

2.    研究分析

華東師范大學沈鴻偉等在慢病毒載體凍干制劑的制備及穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn),海藻糖作為一種良好的凍干保護劑,在制劑制備及穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要作用。這項研究為生物醫(yī)藥制劑等相關(guān)領(lǐng)域提供了新的思路和方法,進一步推動了海藻糖在慢病毒載體凍干制劑制備中的應用。

海藻糖在凍干保護中的優(yōu)勢在于其特別的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。海藻糖是一種非還原性雙糖,具有較好的熱穩(wěn)定性、吸濕性和結(jié)晶性。在冷凍干燥過程中,海藻糖可以有效地保護生物分子和細胞免受損傷,同時還可以抑制冰晶的形成,減少干燥過程中細胞的破裂。此外,海藻糖還具有良好的化學穩(wěn)定性和生物相容性,可以與多種藥物和生物分子結(jié)合,提高制劑的穩(wěn)定性和有效性。

在慢病毒載體凍干制劑的制備中,海藻糖可以有效地保護病毒載體免受損傷,提高制劑的病毒滴度和侵染力。同時,海藻糖還可以抑制制劑的聚集和沉淀,提高制劑的均勻性和穩(wěn)定性。此外,海藻糖還可以通過調(diào)節(jié)制劑的滲透壓和結(jié)晶狀態(tài),控制制劑的復溶時間和質(zhì)量。

3.    凍干保護劑的選擇

凍干保護劑主要可分為以下幾類:一般為多羥基化合物、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、聚合物和無機鹽等化合物。因為凍干保護劑不但要具有保護生物制品活性的效果和結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變,而且要具有凍干賦形的作用。


糖是一種較的凍干保護劑,本研究中采用的海藻糖屬于二糖,比蔗糖具有更低的吸濕性和更高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度,其羥基能替代水分子與蛋白質(zhì)分子表面部分結(jié)合,而且海藻糖分子較小,能填充到蛋白質(zhì)分子的空隙中,有效地限制蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,在凍干時可以對慢病毒的蛋白衣殼形成保護,因此凍干制劑保護效果更好。


氨基酸具有酸性羧基和堿性氨基,能夠調(diào)節(jié)制品溶劑環(huán)境的pH值,不同類別的氨基酸具有不同的親水性功能,而親水性強的氨基酸較易與蛋白質(zhì)產(chǎn)生氫鍵,這對蛋白質(zhì)在凍干的過程中的穩(wěn)定性和活性具有重要的保護作用,如組氨酸、丙氨酸等,可以增加慢病毒載體包膜蛋白和組氨酸磷酸鹽緩沖液間的張力,提高慢病毒載體包膜蛋白水化水平。而加入二價陽離子類,如CaCl2和MgSO4這兩種無機鹽,可延遲海藻糖結(jié)晶,通過和磷酸根陰離子存在下氫鍵網(wǎng)絡以及分子遷移率的變化抑制結(jié)晶。





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